时间：2007-05-14 12:00:00 点击：130
SEC/GPC凝胶渗透色谱分析的工作原理
PS-OBG用作尺寸排除色谱（size exclusion chromatography，又称凝胶渗透，gel permeation chromatography）测量大分子分子量时的标准样品。
首先介绍尺寸排除色谱（SEC/GPC）的工作原理：
如图三所示，红色和紫色两种颗粒代表不同尺寸的两种高分子，蓝色月牙形颗粒代表色谱柱内的填料。通常色谱柱填料是经过设计的具有不同孔径的高分子凝胶珠。当红色和紫色的高分子进入色谱柱以后，以一定速度流动的流动相在不停地冲洗色谱柱的同时，带动高分子颗粒在色谱柱内的移动。当高分子与凝胶珠填料接触时，尺寸大的高分子不能进入凝胶珠填料的孔，如图三中红色的大分子。所以红色的大分子在流动相的冲洗下先流出色谱柱。而紫色的尺寸较小的高分子可以进入凝胶填料珠的小孔，好像暂时被填料保留住了一样，最后由于流动相不停的冲洗，紫色高分子也会流出色谱柱，但是流出的时间较红色分子长了很多。图三右下方给出红色高分子和紫色高分子的凝胶色谱图，横坐标为保留时间，可以看出红色高分子的保留时间明显小于紫色高分子，这说明红色高分子分子量较大，比紫色高分子先流出色谱柱。
色谱柱的工作原理告诉我们，尺寸排除色谱可以将尺寸不同的高分子按照保留时间分开。保留时间越小的高分子（也就是流经色谱柱需要时间越短的高分子）的分子量越大，相反，保留时间越大的高分子（也就是流经色谱柱需要时间越长的高分子）的分子量越小。
懂得了这个原理，我们就可以用SEC/GPC来测分子量了！
但是，如何根据保留时间来确定高分子的分子量呢？也就是说，怎么将不同的保留时间与分子量一一对应起来呢？这时我们需要制定一条标准工作曲线。标准工作曲线的目的是建立保留时间和分子量的关系，当我们用SEC/GPC测定了一个未知的高分子，得到这个高分子的流出时间（保留时间），有了工作曲线，我们就可以很快知道这个未知高分子的分子量。
标准工作曲线的制定
标准工作曲线由一系列分布很窄，分子量已知的高分子标样做出，同时标样的结构和分子链的构象要与未知高分子尽可能的接近。
1． 首先选用与被测样品类型相似的单分散性(d≤1.1)标样。先用其他方法精确测定其绝对分子量（百特纯使用激光光散射的方法测得PS-OBG的绝对分子量）。
2． 然后将PS-OBG标样进行SEC/GPC分析，得到每个窄分布标样的峰位淋洗体积(Ve),也就是每个标样在色谱柱内的保留时间流速。
3． 以Ve为X轴，logM为Y轴作图，这样就可以得到校正曲线。
式中,A,B为常数，A表示排斥极限, B表示渗透极限
4． 将待测高分子进行SEC/GPC分析，得到待测高分子的峰位淋洗体积V’。在标准曲线上将V’推回Y轴得到logM’，此M’即为待测高分子的分子量。
目前世界上生产的和应用的水溶性标样如pullulan和Dextran都是葡聚糖标样，但是在用于尺寸排除色谱标定时，标样的保留时间主要由其动态流体力学体积决定，其次才是分子量。由于Pullulan是线性-（1-4）-和-（1-6）-葡聚糖，dextran是-（1-6）-为主链并含有-（1-3）-（有时是-（1-4）-或-（1-2）-）支链的葡聚糖，这两种葡聚糖在溶液中都是柔顺链的链构象，如果用这样柔顺链的大分子作标样去计算具有较刚性结构的或者链构象具有一定扩张性的天然高分子，将产生非常大的误差，而目前很多应用于生物医用材料的大分子（如用于眼科的透明质酸），生物载药系统的大分子 （如壳聚糖，纤维素，改性淀粉），血液扩张材料（羟基纤维素），和一些生物免疫调节剂（来源于真菌的型葡聚糖）等等，都是具有一定扩张性的生物大分子，燕麦葡聚糖OBG标样与传统的标样相比，可以在标定尺寸排除色谱后更准确地用于常用大分子的分子量标定。
目前使用pullulan作为标准样品的一个主要原因是pullulan制得的标样可以达到很低的分散度1-1.05。将其他天然大分子的分散度制备到1.2左右已经难度很高，所以，尽管pullulan的化学结构只适用于极少数的线型柔顺链高分子，人们还是选用它作标样。长期以来，如何制备适用范围更广，不同结构的窄分布的分子量标样一直是高分子领域具有挑战性的问题而百特纯公司制备的葡聚糖SEC/GPC标样分散度在1-1.005之间，为线型半柔顺链的结构，可以满足更加精准的测试要求。