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动物组织细胞基因组DNA提取
操作步骤
1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g(0.5cm3),尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中,加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块,转入1.5ml 离心管中,加入蛋白酶K
(500ug/ml)20μl,混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min,也可转入37℃水浴12~24h,间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min,PCR,取上清液入另
一离心管中。
2.加2倍体积异,倒转混匀后,可以看见丝状物,用100ul 吸头挑出,凉干,用200ul TE 重新溶解。(可进行PCR反应等,资阳pcr,需要进一步纯化的按下列步骤进行)
3.加等量的酚??振荡混匀,离心12000 rpm,5min。
4.取上层溶液至另一管,加入等体积的?,PCR实验室,振荡混匀,离心12000 rpm,5min。
5. 取上层溶液至另一管,加入1/2体积的7.5mol/L氨加入2倍体积的无水乙醇,混匀后室温沉淀2min ,离心12000 rpm ,10min。
6.小心倒掉上清液,将离心管倒置于吸水纸上,将附于管壁的残余液滴除掉。
7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次,离心12000 rpm , 5min。
8.小心倒掉上清液,将离心管倒置于吸水纸上,将附于管壁的残余液滴除掉,荧光定量pcr,室温干燥。
9.加200ul TE重新溶解沉淀物,然后置于4℃或?C20℃保存备用。
10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。
蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛,是一项重要的操作技术。 一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质,一些含量十分丰富,一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质,必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。
一、主要方法
1. 蛋白质的选择吸附分离(利用颗粒不同程度的颗粒吸附力来使分离的目的达到)。
2. 按照配体特性的分离-亲和层析(利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异结合这一生物性质)。
3. 低温沉淀法,使用如,乙醇等与水可混溶的,降低多数蛋白质的溶解度并且将其析出,和盐析相比较,这种方法的分辨率更加的高,然而蛋白质比较容易变形,需要在低温下进行。
4. 按照分子大小不一样的方法,密度梯度离心(在介质中对蛋白质离心时,蛋白质沉降速度取决于它的质量和密度,质量和密度越大,那么沉降越快;凝胶过滤(一种柱层析);超过滤(利用蛋白质分子不能从半透膜通过的性质)。
5. 按照溶解度差异分离,等电点沉淀法盐溶与盐析(使用一定浓度盐溶液来使蛋白质的溶解度增大或减小);(因为在等电点时蛋白质分子的净电荷为 0,使分子间静电斥力减少了,所以,聚集沉淀比较容易,这时具有小的溶解度)。
6. 按照电荷不同的分离方法。主要分为离子交换层析和电泳分离。
蛋白质互作验证服务
在后基因组时代,基因的表达产物蛋白质作为生物功能直接的执行者和体现者,在生物集体的生理及病理中扮演着重要的角色。高通量的蛋白质组学研究技术可以在上述过程中筛选出具有潜在价值的生物标记和靶点。但是长期以来,大规模的蛋白质表达分析谱并没有提升我们对生物标志物的认识,其主要原因是差异蛋白的分析结果缺乏规模化的验证。