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分子实验介绍——印迹(Western blot)检测
通过SDS-PAGE凝胶将细胞或生物样品内的蛋白按照蛋白分子量从大到小规律分离开。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如纤维素薄膜或PVDF膜)上,fish检测,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的起反应,再与酶或同位素标记的第二起反应(目前主要用HRP标记的第二),实时荧光定量pcr,经过底物显色或自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分(目前主要使用鲁米诺和二抗中的HRP反应发出荧光,通过仪器或者胶片显色)。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验流程:细胞收集-细胞裂解,蛋白提取-蛋白变性-SDS-PAGE电泳-蛋白质转膜印记-蛋白封闭-目的孵育-二抗孵育-显色拍照
结果示例:
图 A不同大小的质粒转染细胞后,Western blot检测图片;B A蛋白不同培养时间后Western blot检测图片;C 使用Image pro plus软件对A蛋白灰度检测,A蛋白表达变化统计图
蛋白质定量组学服务
细胞内蛋白质组丰度的动态变化对不同生命过程有重要影响。例如在许多疾病的发生和发展进程中,常常伴随着某些蛋白质的表达异常。目前定量蛋白质组学技术主要分为标记(label)策略和非标记的(label free)定量策略,其中标记策略又分为体内标记(如 SILAC、15N 标记),攀枝花pcr,以及体外标记(如 iTRAQ、TMT 标记) 。
传统的基于2D双向凝胶电泳分离的蛋白质组通常可以鉴定出约1000种蛋白,对全蛋白质组的覆盖仅在5~10%左右,不能满足高通量定量蛋白质表达谱分析的要求。我们结合样品制备与高分辨率、高灵敏度的液相色谱-质谱联用技术,可在细胞与组织类样品中鉴定直至多于10000个蛋白,对全蛋白质组的覆盖gt;60%。结合生物信息学分析,为您构建高通量蛋白质定量表达谱。
RNA pull down 检测
RNA pull down:RNA沉淀检测,是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验方法之一。使用体外转录将RNA进行生物素标记,并与细胞蛋白裂解液孵育,形成RNA-蛋白复合物。复合物通过磁珠结合后分离,复合物纯化洗脱后通过Western blot验证检测特性的蛋白。若筛选可能结合的蛋白通过质谱实验进行检测筛选。