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聚合酶链式反应(PCR)
操作步骤
1.在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
1QPCR buffer
5 μl
dNTP mix( 2mM )
4 μl
引物1(10pM)
μl 2
引物2 ( 10pM)
2μl
Taq酶(2U/ul)
1 μl
DNA模板( 50ng-1μg/μl )
1 μl
加ddH2O至
μl 50
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上执行扩增。-般:在93°C
预变性3-5min ，进入循环扩增阶段: 93°C 40s→58°C 30s→72°C 60s ，fish检测，循环30-35
次，后在72°C保温7min。
3.结束反应， PCR产物放置于4°C待电泳检测或-20°C长期保存。
4. PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油，需用100ul进行抽提反应混合液，pcr检测，以
除去石蜡油;否则，直接取5- 10μl电泳检测。
逆转录病毒构建及包装
逆转录病毒（Retrovirus）是一类RNA病毒。在逆转录酶的作用下，以病毒RNA为模板合成cDNA再通过DNA、转录、翻译等过程形成病毒颗粒。逆转录病毒表达系统是一种新的重组蛋白表达系统，由逆转录病毒载体、辅助载体（表达病毒包装需要的蛋白质）和包装细胞系组成。逆转录病毒载体在外源基因表达、基因沉默、、生物制药等得到广泛的应用。逆转录病毒载体主要优点：转染范围广，可以各种细胞类型，转入的外源基因可完全融合，对细胞率高，细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因。
逆转录病毒载体系统共有两部分组成：包装细胞系和缺陷病毒本身。在逆转录病毒载体中，去除了正常的蛋白编码序列而保留了和包装信号，通过分子技术将目的基因插入此载体上，而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白。当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配，该病毒颗粒可其它宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。宿主细胞不能像包装细胞那样为缺失结构基因的逆转录病毒提供结构蛋白，因而在宿主细胞内不会产生新的毒颗粒，保证了该载体在生物制品领域的生物安全性问题。
