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一、仪器简介 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。可用于检测如动植物组织、细胞液、全血等样品中目标基因的存在以及相对含量。 使用的荧光化学组分一般可分为两种：荧光探针和荧光染料。 1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5－3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变，如单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步 二、样品要求 1. 请提供已知的全长基因序列和详细背景资料：DNA/RNA来源，丰度； 2. 请您提供新鲜的且尽量多的材料，或直接提供纯化好的总RNA或DNA（大于5ug/样本）。 3. 动物组织：样本离体应当立即放入液氮或-80℃冰箱中速冻保存，避免反复冻融，并且样本在-80℃的保存时间不宜过长，若保存时间超过半年应及时与工作人员取得联系，组织寄送100mg以上，脂肪组织，结缔组织，纤维化组织适当增加，干冰运输； 4.植物：新鲜的叶、果肉、种子等最少需100mg，干冰运输。 5.细胞：1×10^6个细胞，加入trizol的细胞样本（不要直接运输加trizol的细胞培养皿），Trizol 为裂解液，不适用于组织样本的保存，细胞除外，干冰运输； 6.全血：最少1 mL新鲜血液EDTA抗凝管，4度运输； 血清：最少1 mL，干冰运输； 7.RNA样品： OD260/280为1.8-2.0，浓度≥100 ng/μL，体积≥20μL，干冰运输；cDNA：cDNA原液≥20 μL，干冰运输； 8. 送样样本量需至少高于上述提及样本量的三分之一，建议所有样本均做好备份；如果样本特别珍贵，需提前说明。一般情况下，样本不予返还；需要返还的请提前说明，逾期样本将安排清理，样本返回需要客户承担返还费用（包括干冰费和快递费） 三、常见问题 1.无Ct值出现 检测荧光信号的步骤有误:一般SybrGreen法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。 1、引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。 2、模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。 3、模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。 2.Ct值出现过晚（Ct>38） 1、扩增效率低:反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。 2、PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。 3、PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。 3.溶解曲线不止一个主峰 1、引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。 2、引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。 3、镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。 4、模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增
