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一、仪器简介 原理：将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），但细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。通过pull down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外转录或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系GST pull down（GST融合蛋白沉降技术）是体外检测蛋白相互作用的常用方法，用于：一是鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质；二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。 DNA pull-down是体外研究DNA与蛋白互作的有力工具，做western-blot检测特定蛋白是否与靶DNA片段结合；做质谱鉴定即可筛选出与DNA片段可能互作的蛋白信息（如具体某个或某些转录因子/组蛋白等）。 RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用，质谱实验检测特定的RNA结合蛋白鉴定蛋白质类型 二、样品要求 蛋白样品-80℃保存，干冰寄送，下单前请先和工作人员沟通，确认测试细节。 三、常见问题 为什么会有假阳性的结果出现？ 由于内源性蛋白的干扰，高纯度的GST融合蛋白能够减少实验的假阳性。由于高纯度的融合蛋白能减少实验结果的假阳性，因此获得高纯度的融合蛋白对于GST-pull down 实验结果 分析具有重要的作用。同时，为了能够最大程度的保证融合蛋白原有的生物学活性，一般在获取融合蛋白时倾向于可溶性融合蛋白，因此获得高纯度的可溶性蛋白很关键。 对于可溶性蛋白的获得条件主要有①载体的选择。②可溶性蛋白表达条件的选择，③诱导温度，④诱导时间，⑤诱导物的浓度，能够不被细胞代谢而且具有稳定的浓度。 四、DNA pull down 常见问题 1：适配子DNA单链，可以用带有互补链的磁珠进行pull down吗？如果可以，效率怎么样？一般需要怎么优化条件？ 理论上说,若DNA单链能够与磁珠上的互补链杂交成功,是可以进行pull down实验的; 效率如何不好确定,这个取决于两条DNA单链是否能杂交成功、蛋白-DNA结合的强弱、蛋白的丰度等。 2：DNA pull down的 原理？ 针对目标区域设计特异性DNA探针并进行生物素标记，生物素探针可与偶联在磁珠上的链霉亲和素结合；细胞蛋白提取物与磁珠-DNA探针孵育，从而钓取与DNA探针有特异性结合的互作蛋白质。 3：你们对外服务的检测项目有哪些？ 细胞、动物/植物组织、菌体都可以做DNA pull down, 我们还可以做的检测实验具体如下: (1) RNA-蛋白/RNA互作及定位：RNA pull down、RIP、fish等; (2) DNA-蛋白互作：DNA pull down、ChIP、EMSA、双荧光素酶、酵母单杂等; (3) 蛋白-蛋白互作：GST/his pull down、CoIP、酵母双杂等; (4) 细胞学检测：细胞增殖-MTT/CCK-8, 细胞凋亡, 细胞周期,细胞迁移、侵袭：划痕愈合/Transwell/Transwell（Matrigel）等; (5) 外泌体服务：提取、鉴定(Nanosight粒径检测/电镜/WB)、 测序(miRNA/lncRNA)、蛋白质组学; (6) 转录组及蛋白质组：真核有参转录组、无参转录组、真核lncRNA、small RNA等。 4：效率有多高？ 效率主要取决于蛋白-DNA结合的强弱、蛋白的丰度等。 5：老师，对照组的DNA序列是怎么选择的？ 一般对照组是没有探针的,对照组是磁珠beads+蛋白。 6：DNA pull down有什么缺陷吗？ DNA pull down-MS是体外研究蛋白-DNA是否有直接互作的经典技术，是将探针结合在凝胶/磁珠上，钓取与DNA探针有互作的蛋白；就技术而言,没有明显的缺陷;后续质谱能鉴定到多少蛋白取决于蛋白-DNA结合的强弱、蛋白的丰度等。
