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广州澳美实验室系统装备有限公司
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一、试剂盒选择原则 1、敏感性比特异性更重要 去年8月3日沈阳非洲猪瘟疫情确诊之前，我国并不是ASF疫区，根除非洲猪瘟病毒的过程中，诊断技术敏感性与特异性不能兼顾的情况下，敏感性比特异性显得更加重要。用ELISA方法检测ASFV抗体时，间接ELISA较阻断ELISA的敏感性有优势。OIE官方建立的方法，也是间接ELISA(OIE Terrestrial Manual 2012;Chapter2.8.1)。有条件的话，可以采用间接ELISA筛选，阻断ELISA复核。 2、得到非洲猪瘟的实验室检测结果后，阳性结果必然一下子戳中神经，震撼不已，对于阳性结果必然会进行复核。倘若是假阳性，便是虚惊一场。反而阴性结果常常直接略过，不被重视，若此结果是假阴性，那后果将是灾难性的。 真实阳性真实阴性 检测阳性√√√× 检测阴性×××√ 3、PCR和ELISA是非常成熟的技术，商品化试剂盒的方法建立难度不大，而用大量临床样品、田间样品和标准品对商品化试剂盒验证与质控的过程，能够体现出严谨的科学态度。国内先发非洲猪瘟疫情之前并非疫区，无法收集到阳性样品，*的商品化试剂盒的验证存在现实困难。不过日前农业部公布的两批非瘟试剂盒应该经过了验证，实验室可以放心使用。重磅!肇庆大华农通过*二次非洲猪瘟现场快速检测试剂评价 二、荧光定量PCR 笔者认为选择经OIE参考室验证的商品化试剂盒用于ASF监测排查，尽快掌握国内ASF疫情，快速处置，对ASF根除是有利的。部分商品化试剂盒在欧非等传统ASF疫区普遍使用，产品成熟而可靠。 若采取统一“度量衡”，以便于全国检测结果数据的横向比对。采用OIE推荐的非洲猪瘟病毒扩增p72基因分型的通用型引物(p72-D/p72-U)，开展监测排查具有现实可行性。导致检测结果出现假阳性和假阴性结果的因素很多，假阳性的原因自查后会发现，而如何避免假阴性结果的出现，是在检测工作开始之前需要认真考虑的事情。qPCR检测结果的价值取决于所用试剂的质量，除了引物以外，还需要提取试剂、预混液、对照试剂等。 三、提供有效的检测样品是前提 《非洲猪瘟现场排查手册》对样品的采集、包装与运输做出了详细说明，推荐使用“三重包装系统”，运送的样品必须附有做够的冷却材料(如冰袋)，以防变质。确保送达实验室的待测样品是有效的，是开展检测工作的前提。实际基层采样工作中，低温保存和运输是存在现实困难的。在这一方面OIE参考实验室德国FLI实验室(Friedrich-Loeffler-Institute)做了很好的尝试，采用GenoTube拭子采样管做为采样工具，常温运输和保存送达实验室，开展qPCR核酸检测，ELISA和胶体金检测卡抗体检测。更欣喜的是FLI对非洲猪瘟的样品采集进行了验证。 四、建立更严谨而合理的检测体系 设立内部阳性对照(IPC) 有效预防假阴性结果出现 国内兽医实验室qPCR检测中会设立阴性对照和外部阳性对照，但却很少设立内部阳性对照(IPC)。Xeno IPC其实就是与所有物种基因组无交叉的核酸序列，被检测样品结果阴性，Xeno IPC检测结果阳性(Ct值预期范围是已知)，有效证明无qPCR抑制剂存在，从而降低了假阴性结果的风险，对ASF这类重大动物疫病监测具有重要的意义。美国兽医实验诊断协会(AAVLD)在实验室指南中明确推荐Xeno IPC在qPCR检测过程中使用。 五、选择高品质的核酸提取试剂和预混液 PCR检测结果的价值取决于所用试剂的质量。核酸提取试剂盒必须是通用型样品制备试剂盒，可满足实验室对多种样品类型检测需求，并对全血、脾脏、淋巴结、扁桃体和环境样品等进行过验证。模块化技术经过专门优化，能够从较广泛的样品类型之中纯化核酸，具有高简便性、性能一致性并节省时间和成本，从而帮助提高实验室的效率。预混液要求对酶进行优化，以帮助鉴定那些较重要的动物病原体靶标，严格开发的试剂稳定且一致，即使用于较具挑战性的动物样品，在PCR抑制剂存在的条件下也依然有效。简单易用的预混液都能帮助获得值得信赖的结果。 六、环境样品的检测结果反应生物安全防护措施是否得当 做好生物安全防护措施才能有效预防非洲猪瘟的传入已成为共识，问题来了，如何证明生物安全防护措施是否得当?构建完善的生物安全监控网络，有计划的采集动物体和环境样品进行qPCR检测，通过客观数据足以量化生物安全措施的防护程度。尤其是针对猪场交叉区域的出猪台、卖猪车、无害化处理车、员工澡堂地面等区域环境样品的检测。